10x Visium FFPE 空间转录组测序-经典案例

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10x Visium FFPE 空间转录组测序

肾细胞癌的三级淋巴组织产生和繁殖产生抗肿瘤抗体的浆细胞

Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer

发表期刊：Immunity
影响因子：31.745
发表时间：2022年2月

一、研究背景

三级淋巴结构（Tertiary lymphoid structures, TLS）是在成纤维细胞网络上形成的淋巴细胞聚集物，包括T细胞区和滤泡B细胞区。成熟TLS具有生发中心，包含T滤泡辅助细胞（Tfh）和滤泡树突状细胞，并与B细胞密切接触。成熟的TLS与多种癌症临床获益相关。

二、样本类型

130例肿瘤样本进行免疫组化和免疫荧光分析对其中24例肿瘤样本进行空间转录组测序（12个冰冻切片和12个FFPE切片）

三、研究结果

1. TLS+肿瘤中B细胞富集区域
分析24例切片，在23例切片中检测到Ca9基因表达（肾细胞癌标志基因）。空间转录组测序揭示TLS区域特征：（1）B细胞谱系和T细胞分布比例更高；（2）单核细胞谱系特征更高，但NK细胞分布更分散；（3）成纤维细胞特征高表达。图1 TLS+冰冻切片、FFPE切片和TLS-切片特征基因和细胞分布
2. TLS内部和远处免疫球蛋白（Ig）基因表达
结合HE染色、免疫荧光、免疫组化和空间转录组差异表达数据，发现29个TLS印记特征基因，其中17个是Ig和B细胞相关基因。分解B细胞类型发现：① 初始B细胞相关基因表达分散，但显著与TLS相关；② FCRL4+记忆B细胞、生发中心B细胞和浆母细胞与TLS相关。 IGHM基因仅在TLS表达，说明非转换B细胞存在TL S区域；IGHG1、IGHA1和pan Ig基因在TLS和肿瘤表达，与成纤维细胞标志基因共定位，说明同种型转换浆细胞在TLS形成并沿着成纤维细胞扩散到远端。同时， MZB1（浆细胞相关基因）与CXCL12基因表达共定位。图2 FFPE切片免疫球蛋白相关基因表达和共定位
3. 空间BCR识别原位超突变和克隆选择
B细胞成熟亚型与浆细胞共定位说明发生原位B细胞适应性免疫。B细胞通过突变BCR序列选择和扩展克隆。文章结合bulk RNA-seq数据发现TLS具有大量单一的轻链克隆型，突变的V基因转录本数量较少；多数突变序列转录本位于TLS远端肿瘤区域。在47个肿瘤样本中，TLS特征基因表达水平高（TLS-high）的样本，体细胞超突变水平也较高；TLS-high样本中IgH克隆型数量多，比例较高的克隆型被检测超过100次。这些克隆型在TLS内部和远处都能检测到，说明浆细胞在原位TLS成熟、然后被选择、扩增和传播到肿瘤各个区域。
4. TLS的浆细胞沿着成纤维细胞轨迹扩散
为了分析肿瘤内浆细胞、成纤维细胞和CXCL12原位表达位置，利用MUM1（IRF4）标记浆细胞、COL1（Col1a）标记成纤维细胞，揭示COL1+/CXCL12+成纤维细胞与MUM1+ 浆细胞共定位，并且浆细胞和成纤维细胞核之间的距离非常近。在被MUM1+IgG+成纤维细胞轨迹环绕的肿瘤中检测到IgG结合的肿瘤细胞。图4 浆细胞、成纤维细胞和CXCL12原位表达共定位；浆细胞与成纤维细胞核间的距离
5. TLS和IgG浆细胞与结合凋亡肿瘤细胞的IgG抗体和免疫治疗反应相关
TLS+肿瘤中，CAIX+肿瘤细胞膜与抗人类IgG结合，IgG阳性肿瘤细胞比例高，而IgA标记在TLS+和TSL-肿瘤中均较低。IgG标记的肿瘤细胞和MUM1+ IgG+浆细胞浸润相关性较强。为了揭示肿瘤结合IgG抗体的功能，分析肿瘤细胞凋亡特征，在IgG+肿瘤细胞＞60%的样本中， Caspase 3活化的肿瘤细胞密度显著升高。CD68+巨噬细胞与IgG+/cleaved caspase 3+肿瘤细胞距离更近。为了评估IgG肿瘤对ICI治疗患者的影响（35个NI治疗患者和16个Nivolumab治疗患者），采用IgG结合的肿瘤细胞占比60%作为阈值，将人群分为两组， IgG肿瘤细胞比例高的患者生存期更长。图5 IgG结合的肿瘤细胞中Caspase3活化细胞分析和不同免疫治疗下生存期比较
总结
10x Genomics Visium空间转录组测序方法对冰冻切片和FFPE切片测序，鉴定肾细胞癌三级淋巴结构特征，以及浆细胞传播途径与肿瘤细胞Caspase3活化和免疫抑制剂治疗应答的关系。文章为未来肾细胞癌治疗提供了思路。
分析流程图